- LES
SYSTEMES DE SCORES
- LES
ALGORITHMES ET LES PROGRAMMES DE COMPARAISON DE SEQUENCES
2.3 Les
programmes de comparaison avec les banques de séquences
La taille sans cesse croissante des banques de séquences a nécessité
l'élaboration d'algorithmes spécifiques pour effectuer la
comparaison d'une séquence avec une banque de données car
les algorithmes standards de comparaison entre deux séquences sont
généralement trop longs sur des machines classiques. La
plupart de ces programmes constituent des méthodes heuristiques.
Leur but est de filtrer les données de la banque en étapes
successives car peu de séquences vont avoir des similitudes avec
la séquence comparée. Ces méthodes heuristiques utilisent
donc certaines approximations pour éliminer rapidement les situations
sans intérêt et ainsi repérer les séquences
de la banque susceptibles d'avoir une relation avec la séquence
recherchée. Ces programmes permettent ensuite de calculer un score
pour mettre en évidence les meilleures similitudes locales qu'ils
ont observées. Il existe de nombreux programmes qui répondent
à cette fonction avec des approches qui peuvent être très
différentes. Nous nous limiterons ici à la description détaillée
des deux types de programme les plus utilisés par les biologistes
qui sont les logiciels FASTA (Pearson et Lipman, 1988)
et BLAST (Altschul et al., 1990).
Ces programmes ont une approche différente mais complémentaire
pour effectuer des recherches à travers une base de données,
mais sont basés tous les deux sur des méthodes très
heuristiques. C'est pourquoi ils doivent être utilisés essentiellement
comme logiciels permettant de repérer les séquences de la
banque susceptibles d'avoir des ressemblances biologiques avec la séquence
recherchée. Ils ne constituent pas des programmes optimisés
pour comparer deux séquences entre elles. Très souvent,
les résultats qu'ils procurent devront être confirmés
ou renforcés par d'autres programmes plus spécialisés
en particulier dans la recherche de caractéristiques biologiques.
Actuellement, seule, l'utilisation de machines parallèles ou massivement
parallèles et de machines dites câblées donnent la possibilité
d'utiliser des algorithmes plus rigoureux comme celui de Smith et Waterman
(1981) pour la comparaison
avec une banque de données.
2.3.1 Le logiciel FASTA
L'algorithme
est basé sur l'identification rapide des zones d'identité
entre la séquence recherchée et les séquences de
la banque. Cette reconnaissance est primordiale car elle permet de considérer
uniquement les séquences présentant une région de
forte similitude avec la séquence recherchée. On peut ensuite,
à partir de la meilleure zone de ressemblance, appliquer localement
à ces séquences un algorithme d'alignement optimal. Le logiciel
regroupe en fait deux programmes de recherche avec les banques de données.
Le premier est le programme FASTA qui possède une version nucléique
et protéique et le deuxième est le programme TFASTA qui
recherche une séquence protéique avec les séquences
d'une base nucléique traduite dans les 6 phases.
Les
différentes étapes de l'algorithme
Pour chaque
séquence de la banque, l'algorithme se déroule en quatre
étapes sélectives distinctes qui permettent de cibler rapidement
et précisément les régions intéressantes pour
l'alignement optimal.
- La première étape consiste à repérer les
régions les plus denses en identités partagées par
les deux séquences. La codification numérique des séquences
est ici utilisée (voir la recherche de segments identiques) avec
une longueur des segments codés (k-tuple) qui est généralement
de 1 ou 2 pour les protéines et de 4 à 6 pour les acides
nucléiques. Cette étape confère à l'algorithme
l'essentiel de sa rapidité.
- Dans une deuxième étape, on recalcule à l'aide
d'une matrice de scores élémentaires un score pour les dix
meilleurs régions d'identité trouvées dans l'étape
précédente en considérant éventuellement des
associations non exactes entre certains éléments des séquences.
Pour les protéines, on utilisera ici une matrice de substitution
comme la PAM250 de Dayhoff ou la BLOSUM50. Cette deuxième étape
correspond donc à une recherche de similitudes sans insertion-délétion
uniquement sur les régions de haute identité. Les scores
obtenus correspondent à des régions initiales de premier
ordre et l'on qualifie de score init1 celui qui représente la région
de plus fort score parmi les dix analysées.
- La troisième étape essaie de joindre les régions
définies à l'étape précédente, bien
entendu s'il en existe au moins deux et si chacune de celles-ci possède
un score supérieur à un score seuil prédéfini.
Ce seuil correspond en fait à un score moyen attendu pour des séquences
non apparentées. On réunira ces régions initiales
à chaque fois que la somme de leur scores diminuée d'une
pénalité de jonction est supérieure ou égale
au score init1. Ce score s'il existe est appelé initn et correspond
à une région initiale de deuxième ordre.
- La quatrième étape consiste à effectuer l'alignement
optimal de la séquence recherchée avec la séquence
de la banque en considérant uniquement les parties des séquences
délimitées par la meilleure région initiale de score
initn (qui est égale à init1 s'il n'y a pas eu de jonction
à l'étape 3). On obtient alors un score optimal dénommé
opt. Cet alignement est effectué uniquement pour un nombre limité
de séquences fixé par l'utilisateur. Ce sont les séquences
qui correspondent aux plus hauts scores initiaux initn.
Ces quatre étapes de l'algorithme sont résumées dans
la Figure 18. Une estimation
statistique est donnée en traçant l'histogramme des meilleures
scores obtenus pour chaque séquence de la banque avec le calcul
de la moyenne et de l'écart type liés à cette distribution.
Cette estimation utilise la théorie selon laquelle les similarités
locales d'une séquence comparée avec une banque de données
suit une distribution de valeurs extrêmes (voir par exemple Altschul
et al.,1994).
Les
qualités de l'algorithme
L'algorithme
possède une bonne sensibilité du fait qu'il prend en compte
les insertions-délétions. Ceci est fait en minimisant les
explorations entre les deux séquences puisqu'on ne considère
que les séquences potentiellement intéressantes pour effectuer
l'étape de programmation dynamique, en ciblant de plus, les régions
où l'on doit effectuer la recherche d'alignement. L'étape ultime
d'alignement optimal est réalisée uniquement sur la meilleure
région de haute similitude même si d'autres régions
possèdent un score suffisant pour l'effectuer. Cela permet d'éviter
en partie le bruit de fond dû à des motifs non significatifs et
intrinsèques à la séquence recherchée mais
a l'inconvénient de ne pas pouvoir considérer de grandes
insertions durant l'alignement des séquences. Cette lacune est
maintenant évitée dans la dernière version du logiciel
(Octobre 1995) pour l'alignement des séquences protéiques.
En effet celle-ci considère la totalité des séquences
pour effectuer l'algorithme d'alignement local de Smith et Waterman (1981)
plutôt que d'effectuer l'alignement global de Needleman et Wunsch (1970)
uniquement sur des portions de séquences protéiques. L'édition
des résultats est maintenant triée en fonction des scores
opt contrairement aux premières versions qui considéraient
les scores initiaux (initn), ce qui rendait parfois difficile la détection
d'un alignement dont le score optimal est bon mais dont le score initial
initn est médiocre. Enfin Pearson (1990)
explique que lorsque le score opt est plus faible que le score initn,
alors la similitude est souvent inintéressante.
L'estimation
statistique est faite à partir des scores obtenus avec l'ensemble
des séquences de la banque. Cependant, le logiciel fournit également
des programmes d'estimation statistique basés sur une méthode
de Monte Carlo (cf. l'évaluation des résultats) pour estimer
la validité d'un score opt particulier entre une séquence
de la banque et la séquence recherchée. Il s'agit des programmes
PRDF et PRSS qui considèrent une distribution de valeurs extrêmes
pour les scores aléatoires et qui sont directement inspirés
du programme PRDF2 (Pearson, 1990)
qui regroupe les séquences en courts segments pour effectuer les
simulations. Le programme PRDF produit des simulations selon l'algorithme
de Needleman et Wunsch appliqué localement pour l'étape
d'alignement optimal alors que le programme PRSS utilise l'algorithme
complet de Smith et Waterman entre deux séquences protéiques.
Quelques
serveurs des programmes FASTA :
[EBI](Angleterre) [DISC](Japon)
[IGH](France)
2.3.2 Le logiciel BLAST
L'intérêt
de l'algorithme est que sa conception est basée sur un modèle
statistique. Celui-ci a été établi d'après
les méthodes statistiques de Karlin et Altschul (1990
; 1993) qui s'appliquent aux
comparaisons de séquences sans insertion-délétion.
L'unité fondamentale de BLAST est le HSP (High-scoring Segment
Pair). C'est un couple de fragments identifiés sur chacune des
séquences comparées, de longueur égale mais non prédéfinie,
et qui possède un score significatif. En d'autres termes, un HSP
correspond à un segment commun, le plus long possible, entre deux
séquences qui correspond à une similitude sans insertion-délétion
ayant au moins un score supérieur ou égal à un score
seuil. Un deuxième score MSP (Maximal-scoring Segment Pair) a été
défini comme étant le meilleur score obtenu parmi tous les
couples de fragments possibles que peuvent produire deux séquences.
Les méthodes statistiques de Karlin et Altschul sont appliquées
pour déterminer la signification biologique des MSPs et par extrapolation
la signification des scores HSPs obtenus lors de la comparaison. Ce logiciel
possède en fait quatre programmes distincts de comparaison avec
les bases de données. BLASTN (séquence nucléique
contre base nucléique), BLASTP (séquence protéique
contre base protéique), BLASTX (séquence nucléique
traduite en 6 phases contre base protéique), et TBLASTN (séquence
protéique contre base nucléique traduite en 6 phases).
Les
différentes étapes de l'algorithme
La stratégie
de la recherche consiste à repérer tous les HSPs (fragments
similaires) entre la séquence recherchée et les séquences
de la base. Pour déterminer un HSP, des mots de longueur fixe sont
identifiés dans un premier temps entre la séquence recherchée
et la séquence de la banque. Dans le cas des acides nucléiques,
cela revient à des recherches d'identité entre les deux
séquences sur des segments de longueur fixe (généralement
11). Par contre dans le cas des protéines, on effectue d'abord
une liste de mots similaires pour chaque mot de longueur fixe (généralement
3) de la séquence recherchée et l'on repère ensuite
dans la banque les séquences qui possèdent au moins un de
ces mots. Un mot similaire est un mot qui, comparé avec un mot
de la séquence recherchée, obtient un score supérieur
à un score seuil lorsque l'on considère une matrice de substitution.
Dans un deuxième temps, on cherche à étendre la similitude
dans les deux directions le long de chaque séquence, à partir
du mot commun, de manière à ce que le score cumulé
puisse être amélioré.
L'extension s'arrêtera dans les trois cas suivants:
- Si le score cumulé descend d'une quantité x donné
par rapport à la valeur maximale qu'il avait atteint.
- Si le score cumulé devient inférieur ou égal à
zéro.
- Si la fin d'une des deux séquences est atteinte.
La signification des segments similaires obtenus est ensuite évaluée
statistiquement. Celle-ci est faite en fonction de la longueur et de la
composition de la séquence, de la taille de la banque et de la
matrice de scores utilisée. Cette estimation donne en fait la probabilité
que l'on a d'observer au hasard une similitude de ce score à travers
la banque de séquences considérée. Lorsque plusieurs
HSPs sont trouvées sur la même séquence, le programme
utilise alors une méthode de "somme statistique" (Karlin et Altschul,
1993) qui considère
que la signification statistique d'un ensemble de HSPs doit être
plus élevée que n'importe quel HSP appartenant à
cet ensemble. Les HSPs, dont la signification statistique satisfait une
valeur seuil désignée par l'utilisateur sont ensuite édités.
Les
qualités de l'algorithme
Le principal
avantage est que le fondement de l'algorithme s'appuie avant tout sur
des critères statistiques. Un autre point intéressant de
la méthode (essentiellement pour les protéines) est que
la première étape de reconnaissance des similarités
ne recherche pas uniquement des zones d'identité mais accepte la
présence de similitudes en considérant une matrice de scores.
Ceci permet d'intégrer dès le début de la recherche
les critères biologiques compris dans la matrice. De plus, les
résultats peuvent être édités selon plusieurs
tris possibles et en particulier selon leur signification statistique
et non suivant la valeur de leur score. On retrouvera donc les segments
les plus probables en début de liste. Ce logiciel a été
très optimisé dans son écriture, notamment par une
précodification de la banque, ce qui lui vaut d'être un des
plus rapides tout en conservant une sensibilité satisfaisante.
De plus, il possède des versions qui s'exécutent sur machines
parallèles.
Comme
la recherche dans la banque de données est basée sur l'identification
de segments, le bruit de fond est plus présent dans ce type d'approche.
Il est généralement du à des qualités intrinsèques
de la séquence recherchée comme la présence de régions
répétées internes, ou la présence de segments
de basse complexité non spécifiques d'une caractéristique
biologique mais communs à plusieurs familles de protéines,
par exemple les segments basiques ou acides. Des logiciels complémentaires
qui opèrent comme filtres peuvent être utilisés comme
paramètres dans les programmes BLAST pour remédier à
ces problèmes. Ainsi, le programme SEG (Wootton et Federhen, 1993)
masque des régions de faible complexité et le programme
XNU (Claverie et States, 1993)
cache des régions répétées de courte périodicité.
Quelques
serveurs des programmes BLAST :
[NCBI](USA) [ExPASy](Suisse)
[IGH](France)
2.3.3 L'utilisation de machines spécialisées
Depuis
quelques années, de nouvelles générations d'ordinateurs,
avec des architectures différentes, sont nées et permettent
d'accroître sensiblement la performance de certains algorithmes. On peut
réunir ces super calculateurs en deux catégories.
La
première est celle des ordinateurs massivement parallèles
qui possèdent de nombreux processeurs (par exemple, 4096 pour une
Maspar) et qui donnent la possibilité d'effectuer une tâche simultanément
sur chacun des processeurs. Il est évident que ce genre d'architecture
convient tout à fait à la comparaison d'une séquence
avec toutes les séquences d'une banque en utilisant un algorithme
qui est répété autant de fois qu'il existe de séquences
dans la banque. C'est ainsi que le serveur BLITZ
à l'EMBL propose le programme MPSEARCH qui est une implantation
de l'algorithme de Smith et Waterman sur une Maspar (Sturrock et Collins,
1994).
La
deuxième catégorie est celle des ordinateurs dits "câblés".
Ces machines sont conçues exclusivement pour effectuer une ou plusieurs
tâches précises. Autrement dit, l'algorithme est "soudé"
dans la machine. Ce genre d'architecture, coûteuse et qui permet peu d'évolution,
fait de plus en plus place à l'utilisation de processeurs personnalisés,
c'est à dire dont la fonction peut être reprogrammée.
Ainsi, BIOCCELERATOR est une carte spécialisée pour l'analyse
des séquences qui peut posséder jusqu'à 16 processeurs
associés à quatre modules : un pour l'algorithme de Smith
et Waterman (1981), un pour
le programme de recherche de motifs protéiques PROFILESEARCH (Gribskov
et al., 1990), un pour le
programme FASTA (Pearson et Lipman, 1998),
et un pour le programme d'alignements multiples PILEUP issu de la méthode
décrite par Higgins et Sharp (1989).
Il est possible d'utiliser une telle carte par requête
WWW.
2.3.4 La disponibilité des programmes à travers les réseaux
informatiques
Les
programmes de comparaison avec les bases de données sont devenus
aujourd'hui des outils très couramment utilisés par les
biologistes. Néanmoins, il est évident que chacun ne peut
pas disposer dans son laboratoire des matériels les plus sophistiqués
et les plus puissants pour effectuer ces tâches rapidement. C'est pourquoi,
il existe un nombre croissant de serveurs qui permettent l'utilisation
gratuite de ces programmes avec des banques de données actualisées
quotidiennement. On trouve principalement sur ces serveurs les programmes
de comparaison qui sont des standards dans le domaine comme les logiciels
FASTA et BLAST ou comme nous l'avons vu au paragraphe précédent,
l'implantation de certains algorithmes sur des matériels spécialisés.
Tous ces serveurs sont accessibles via les réseaux informatiques
à hauts débits par l'utilisation des messageries électroniques
ou de systèmes infocentres tels que WAIS, gopher ou WWW. Une liste
des principaux serveurs français et étrangers en biologie
et bioinformatique est donnée ici.
2.4 Les
programmes de recherche de motifs
2.4.1 "motif" et "pattern"
Dans la littérature
les motifs sont qualifiés en termes anglo-saxons de "pattern"
ou de "motif". Un "motif" est généralement
un segment court, continu et non ambigu d'une séquence alors qu'un
"pattern" a une structure plus complexe. Il est souvent composé
de différents "motifs" qui peuvent être plus ou moins éloignés
les uns des autres et sa définition peut comporter des exclusions
ou des associations de "motifs". C'est pourquoi, il est parfois nécessaire
d'utiliser implicitement ou explicitement des opérateurs logiques
tels que le OU, le ET ou le NON dans sa définition. On peut considérer
très souvent qu'un "motif" est une séquence exacte ou peu
dégénérée et qu'un "pattern" est une séquence
dégénérée et/ou composée. Dans ce mémoire
nous emploierons le terme générique français motif pour
désigner l'ensemble de ces définitions.
2.4.2 Les différents types de motifs
Il
existe plusieurs raisons de rechercher des motifs à travers les
séquences car ils sont généralement impliqués
dans des systèmes de régulation ou définissent des
fonctions biologiques. Parmi ces raisons, on peut citer la détermination
de la fonction d'une nouvelle séquence (par exemple en localisant
un ou plusieurs motifs répertoriés dans des bases de motifs),
l'identification dans une séquence nucléique de régions
codantes (par exemple en repérant les codons d'initiation et de
terminaison, les sites d'épissages et les zones de fixation des
ribosomes), la recherche d'un motif particulier dans une séquence
(par exemple en identifiant sur une séquence les sites de coupures
d'enzymes de restriction ou des promoteurs spécifiques etc...),
ou bien l'extraction à partir des banques de données (par
exemple extraire des séquences possédant le même signal
de régulation ou la même signature protéique pour
effectuer des études comparatives ultérieures).
Il
est donc évident qu'il existe des niveaux de complexité
très différents dans la définition des motifs. Certains
sont précis et non ambigus comme les sites de reconnaissance des
enzymes de restrictions ou comme certains motifs de protéases.
D'autres peuvent être beaucoup plus flous et complexes comme les
motifs consensus liés à des familles de protéines
ou les facteurs de transcription. Dans ce cas, la difficulté est
souvent de savoir quel motif utiliser et quelle est la pertinence de la
définition. Staden (1990)
a répertorié divers critères et éléments
qui peuvent intervenir dans la définition d'un motif. On y trouve
les critères les plus simples comme la ressemblance par rapport
à un motif exact aux critères les plus complexes comme l'ensemble
des acides aminés permis à une position donnée ou
la composition d'un motif en plusieurs sous-motifs séparés
par des régions variables. On y recense également par exemple,
l'éventualité de trouver des régions répétées
ou bien encore la définition d'une matrice consensus donnant la
probabilité de chaque position. En fait, on peut regrouper les
éléments de définition qu'il décrit en deux
catégories distinctes, ceux qui sont liés à la structure
primaire des séquences et ceux qui constituent des structures secondaires.
Avec l'extension de la détermination de structure d'ADN ou de protéine
par les méthodes de diffraction des rayons X ou de résonance
magnétique nucléaire (RMN), il est possible maintenant d'ajouter
de plus en plus de critères tridimensionnels dans la définition
des motifs. C'est sans aucun doute une des voies de recherche les plus
prometteuses des prochaines années pour caractériser des
sites complexes comme ceux impliqués dans les associations ADN-protéines.
2.4.3 La définition des motifs
La
qualité de la définition d'un motif dépend effectivement
de sa complexité, mais également du choix de la représentation
des informations qui le composent. Nous décrirons ici les principales
méthodes utilisées dans la définition des motifs
qui constituent généralement le formalisme de base pour
les représenter. Ces méthodes s'attachent à décrire
la suite des résidus définissant le motif et reposent essentiellement
sur des comparaisons de séquences. On ne parlera pas des méthodes
plutôt statistiques comme les analyses de fréquences dans les régions
promotrices ou des méthodes liées à l'apprentissage
comme celles utilisées dans les réseaux neuronaux. Même
si beaucoup de critères sont communs lors de la définition
des motifs nucléiques et protéiques, il nous a paru intéressant
de distinguer ces deux types de motifs pour mettre mieux en évidence
certaines spécificités.
Les
motifs nucléiques
La définition
d'un motif nucléique commence en général par l'analyse
d'un alignement multiple de toutes les séquences connues comme
étant actives pour la fonction étudiée. Cela permet
de connaître pour chaque position la variabilité en bases. L'alignement
de ces séquences peut servir à produire une séquence
consensus, une table de fréquences ou une matrice de pondération
des éléments qui composent le motif. La séquence
consensus rend compte de la ou des bases les plus fréquemment rencontrées
pour chaque position. Dans le cas de séquences très spécifiques,
cette simple séquence suffit pour décrire de manière
satisfaisante une région active. Malheureusement, dans la plupart
des cas comme pour les facteurs de transcription, elle ne suffit pas pour
identifier les sites biologiquement actifs car elle n'est pas forcément
celle qui est le plus souvent rencontrée comme signal. Au pire
elle peut elle-même ne pas exister en tant que signal ! Ceci est
du essentiellement au fait que l'on considère l'indépendance
entre les positions durant l'établissement du consensus et que
ce dernier ne représente qu'un résumé de toutes les
séquences effectivement actives. Pour éviter en partie ce
problème, un nombre maximum de positions pour lesquelles on tolère
la non identité par rapport à la séquence consensus
peut être incorporé dans la définition du motif. On
parle alors d'éloignement ou de distance à la séquence
consensus (Mengeritsky et Smith, 1987).
Pour
exprimer l'ambiguité et la complexité d'un motif, on peut
également déduire de l'alignement des séquences une
table de fréquences en comptabilisant les occurrences de chaque
base à chaque position du motif. En d'autres termes, on définit
à partir d'un échantillon donné, la probabilité
d'apparition des bases pour chaque position du motif. Il est possible
ensuite, pour augmenter la fiabilité des probabilités, de
considérer des critères supplémentaires, intrinsèques
aux séquences, comme la thermodynamique liée au motif étudié
ou la fréquence attendue des bases selon la région où se
trouve le motif. On peut ainsi, considérer que l'apparition d'une
cytosine est plus significative que l'apparition d'une guanine dans une
zone riche en guanine. La transformation de la table des fréquences
en tenant compte éventuellement de critères supplémentaires
donne naissance à une matrice de pondération (weight matrix).
Celle-ci est généralement construite en prenant le logarithme
de la fréquence de chaque base à chaque position pour optimiser
les différences contenues dans la table des fréquences.
Pour prendre en compte des critères supplémentaires comme
le pourcentage des bases de la région étudiée, chacune
des valeurs logarithmiques pourra être divisée par la fréquence
génomique de la base observée. On trouvera dans la littérature
plusieurs exemples et méthodes de génération de matrices
de fréquence ou de pondération (Bucher, 1990
; Stormo, 1990).
Les
motifs protéiques
La définition
des motifs protéiques se représente généralement
de deux manières, soit par la détermination d'une séquence
consensus qui est généralement complexe (avec des ambigu•tés
à certaines positions et des sous-séquences séparées
par des régions variables), soit en fournissant directement sous
forme d'alignement multiple, toutes les portions de séquences qui
ont servi à l'élaboration du consensus.
Pour
établir une séquence consensus, on peut réunir toutes
les séquences appartenant à une même famille (par
exemple, les cytochromes ou les kinases). On recherche ensuite les zones
spécifiques qui peuvent être considérées comme
caractéristiques de ces séquences, ceci en s'aidant des
données disponibles dans la littérature et si possible d'experts
de la famille considérée. Les motifs ainsi obtenus sont
alors systématiquement recherchés dans une banque de séquences
protéiques pour estimer leur fiabilité qui repose sur le
nombre de faux positifs et de faux négatifs identifiés.
Une bonne définition doit minimiser ces deux nombres. C'est une
des méthodes qu'utilise Amos Bairoch pour constituer la banque
de motifs protéiques PROSITE (Bairoch, 1993).
On peut également utiliser pour définir un motif protéique
une méthode globale qui, à partir d'un grand ensemble hétérogène
de séquences, permet de regrouper des séquences possédant
le même motif. Cette démarche est appliquée pour établir
la base PRODOM (Sonnhammer et Kahn, 1994).
Les séquences de la base Swissprot sont comparées deux à
deux avec le programme BLAST pour permettre de regrouper tous les segments
protéiques similaires. On parle ici de domaine protéique
qui caractérise statistiquement une famille de protéines.
Ces domaines peuvent être employés comme motifs spécifiques
pour savoir si une nouvelle séquence s'apparente ou pas à
l'un de ces domaines. Enfin, comme pour les séquences nucléiques,
on peut aussi effectuer un alignement multiple des régions qui
caractérisent une fonction et en déduire un motif consensus
protéique.
La
deuxième manière de définir un motif protéique
est de fournir l'ensemble des sous-séquences qui ont servi à
établir ou à valider le motif consensus. Ainsi la base BLOCKS
(Henikoff et Henikoff, 1991)
donne sous forme d'alignements multiples sans insertion-délétion
(ou blocs) les sous- séquences de Swissprot qui correspondent à
des régions conservées. Ces régions sont des segments
protéiques trouvés durant l'analyse de groupes spécifiques
de protéines comme les kinases. L'intérêt d'une telle
définition est qu'elle donne pour chaque position le degré
de conservation ou de variabilité des acides aminés concernés.
Par contre, pour certaines signatures protéiques, composées
de plusieurs segments séparés par des régions de
longueurs variables, elle nécessite la considération de
plusieurs blocs.
Finalement,
on peut considérer qu'il existe principalement deux façons de représenter
l'information contenue dans les motifs, une assez résumée
qui est la séquence consensus et l'autre qui permet de considérer
les variations à chaque position qui sont les matrices consensus
pour les séquences nucléiques et la présentation
sous forme d'alignements multiples pour les protéines.
2.4.4 Les algorithmes de recherche de motifs
Comme
nous l'avons décrit ci-dessus, les motifs peuvent être définis
principalement de deux manières différentes. Des algorithmes
ont donc été développés pour exploiter chacun
de ces deux types de définition.
Les
algorithmes exploitant des motifs consensus
Lorsque les
motifs recherchés sont des motifs simples, c'est-à-dire
peu dégénérés, comme les sites de coupures
des enzymes de restriction ou certains signaux très conservés,
les algorithmes utilisés sont généralement ceux développés
pour les recherches de similitude entre deux séquences, le motif
étant considéré comme une des deux séquences
à comparer. Les algorithmes utilisant une matrice de points comme
le programme DIAGON de Staden et les programmes de recherche d'identité
sont donc assez souvent employés. Si l'on veut introduire la notion
d'insertion-délétion, l'algorithme dérivé
de celui de Needelman et Wunsch adapté au traitement de séquences
de longueur très différente est souvent utilisé.
Celui-ci est identique dans le principe à un alignement global
mais permet de considérer chaque position d'une séquence
longue comme étant un point de départ d'alignement avec
une séquence courte (cf. la recherche d'alignements optimaux).
On pourra ainsi localiser dans une grande séquence la position
où le motif s'aligne le mieux.
Si
le motif recherché est beaucoup plus dégénéré
et complexe, ou si la recherche s'effectue sur plusieurs séquences,
alors il vaut mieux utiliser des programmes qui reprennent les algorithmes
de base de comparaison de séquences mais qui ont été
adaptés et optimisés pour rechercher des motifs complexes.
Ces programmes considèrent généralement un motif
complexe comme étant une collection de motifs simples qu'il faut
rechercher sur une séquence. Il en existe de nombreux. Par exemple,
pour accélérer la recherche de motifs simples dans les séquences
nucléiques, le programme PATTERN (Cockwell et Giles, 1989)
construit une matrice d'identité du motif recherché et le
programme FASTPAT (Prunella et al., 1993)
utilise une compression des caractères représentant les
séquences.
Les
algorithmes exploitant des tables de fréquences
Lorsqu'un
motif nucléique est défini sous forme de table de fréquences
ou de probabilités, on calcule pour chaque fragment de la séquence
à analyser un score. Celui-ci est déterminé en sommant
les valeurs trouvées dans la table selon les bases rencontrées
dans le fragment étudié et les positions considérées
(Stormo, 1990). Il existe
en fait une correspondance entre ce score et la probabilité de
trouver le motif recherché à la position déterminée
par le fragment. Plus le score est élevé, plus le segment
analysé a des chances de correspondre au motif recherché.
Une estimation de la signification du score peut être faite en considérant
les valeurs maximales et minimales théoriques données par
la table et les valeurs maximales et minimales observées sur la
séquence (Figure 19).
Une visualisation graphique des résultats est souvent très
représentative des potentialités qu'il existe de trouver
un motif le long d'une séquence (Figure
20). En fait, l'intérêt principal de cette méthode
réside dans la possibilité de prendre en compte une certaine
similitude par rapport à un motif consensus. La plupart des logiciels
possédant un ensemble de méthodes d'analyse de séquences
proposent ce genre de programmes pour rechercher différents signaux
nucléiques sur une séquence. Nous pouvons citer par exemple
le programme MATRIX SEARCH (Chen et al.,1995)
qui détermine des scores sur la séquence analysée
en sommant des valeurs logarithmiques calculées à partir
d'une matrice de pondération, du nombre de séquences utilisées
pour établir la matrice, de la longueur du motif recherché
et de la fréquence génomique des bases.
Si
le motif est défini par un alignement protéique, la méthode
utilisée est celle dite d'une comparaison par profil (Gribskov
et al., 1987 ; Gribskov et
al., 1990). Elle consiste
à convertir l'alignement multiple en une table qui reflète
la probabilité pour chaque acide aminé de se trouver à
une position particulière du motif, tout en considérant
les propriétés mutationelles des acides aminés selon
une matrice de substitution comme la matrice de Dayhoff. Cette table est
appelée le profil du motif. Elle correspond en fait à une
matrice de pondération particulière. Des méthodes
basées sur une extension de l'algorithme de Smith et Waterman (1981)
permettent ensuite d'aligner une séquence avec ce profil. Le principal
intérêt de cette méthode est qu'elle permet l'introduction
d'insertion-délétion dans la recherche tout en gardant une
souplesse dans la définition du consensus. Beaucoup de programmes
sont dérivés de ce type d'approche. Le programme PROFILESEARCH
en est l'application direct (Gribskov et al., 1990).
Nous pouvons citer également le programme SCRUTINEER (Sibbald et
Argos, 1990) qui permet de
combiner avec la comparaison du profil d'autres critères comme
la présence de structures secondaires ou la distance qui sépare
des sous-motifs, le programme PATMAT (Wallace et Henikoff, 1992)
qui possède une bonne interface utilisateur mais qui ne considère
pas l'introduction d'insertion-délétion durant la comparaison
avec le profil, ceci pour diminuer le temps de recherche, ou encore le
programme BLOCKSEARCH (Fuchs, 1993)
qui recherche sur une séquence protéique l'ensemble des
blocs protéiques contenus dans la base BLOCK convertis en profil.
2.4.5 Vers un formalisme plus complet de la caractérisation
des motifs nucléiques
La
complexité des structures primaires est très inégale
entre les acides nucléiques composés d'un alphabet de quatre
lettres et les protéines composées d'un alphabet de vingt
lettres. Cette situation engendre forcément des disparités
que l'on retrouve au niveau des éléments et des méthodes
de description des motifs. Par exemple, la structure primaire d'un motif
protéique est souvent suffisante pour caractériser un site
biologiquement actif, même si celui-ci est ambigu à certaines
positions. C'est d'ailleurs pour cette raison que l'utilisation à
grande échelle, de méthodes de recherche de similarité
à travers les banques, donne des résultats intéressants
dans l'identification de motifs protéiques conservés. Par
contre, la faible complexité des motifs nucléiques conduit
à une définition, en terme de structure primaire, souvent
insuffisante. De ce fait, pour les séquences nucléiques,
les définitions et les méthodes de repérage de motifs
que nous venons de décrire constituent un formalisme de base qu'il
est souvent nécessaire d'étoffer. Ceci est d'autant plus
vrai pour les sites impliqués dans des systèmes de régulation
complexes comme notamment les sites nucléiques de fixation protéique.
D'autres critères ont donc une importance et doivent être
pris en compte pour affiner la définition du motif. On peut, par
exemple, considérer la localisation du site ou le degré
d'affinité de la protéine régulatrice pour le site
de fixation. On peut également rechercher des structures particulières
qui peuvent s'associer au site comme des zones symétriques ou palindromiques.
Ces éléments supplémentaires doivent non seulement
être intégrés systématiquement dans les définitions
et les recherches mais également dans le formalisme de base des
motifs. Or ces formalismes de base ne permettent pas toujours d'intégrer
tous les critères nécessaires à une bonne description.
Par exemple, les tables de fréquences considèrent que les
positions du motif sont indépendantes les une par rapport aux autres,
empêchant ainsi des considérations de symétrie ou
prenant difficilement en compte l'exclusion d'une base à une position
précise. L'ensemble de ces réflexions montre qu'il est souvent
nécessaire de développer des outils adaptés aux particularités
des signaux étudiés, en mettant au point des protocoles
qui intègrent le maximum d'informations décrites dans les
définitions et qui utilisent si possible plusieurs méthodes
d'analyse de séquences.
©
CITI2, DSI 1997
|
